總蛋白提取

時間：2021-11-05 19:34:29 資料我要投稿

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總蛋白提取

、一胞裂解物的制備：

細．1單去污裂劑緩沖液：1解%N-4P或0Titorn -X10 0裂解緩液沖系：體

N-P4 o0 Tritonr10-01% T

rs-iCH (lpH 8.0)50 mmlo/L Na

lC1 50mml/L oP

MF（苯甲基S酰氟）磺 01.momlL/(001gμ/l)m Pe

ptasitn胃蛋(酶白制抑劑) 1moμlL(/0.μ7g/m)

leLpuetipn（抑亮肽制 0.5mg）ml /

pAortiinn（蛋抑白酶）肽0.3moμ/L(l1μ/gl) m

（注：MPS F貯存液1：00mmo/Ll即714m./mg于異丙醇l；中

Aroptinni貯液：10mg/存ml于0溶.0m1o/LHElESPp(8.0)H; L

eueptinp 貯液存1：0m/gm溶l水于中；

ePptasitn 貯存 10液mgml于甲醇/中.液均于20-℃存保）操

作程序：* 離

收心1×10集個細胞7

加*4入預(yù)冷1℃N%-P0裂解410液0μl

*烈劇蕩震細使胞充懸分浮勻混如為組織進行勻漿（） *

4放℃15置~0mi3n

* 4℃心離，1 0500rm,1p0in，取上清備用。m

二、蛋質(zhì)濃白度測定

：.簡單1：的用28n0測m光值吸標準，線曲2

精.的：用bio確r-d a劑試盒具，見體件附三

、丙聚酰烯胺凝電泳（SDS-膠APGE）

樣和品層積中含膠rTsi-l(CHp6.)，上下槽8緩沖含液rTs-甘i酸(氨p8H3)，.離分中膠含rTi-sl(CH8.8)p的。統(tǒng)系所中組分有含都0.1有的％DSS，樣品和積膠中的層離氯形子成動界面的移導(dǎo)先界邊而甘酸氨分則子成組尾隨邊界在，移動界面兩的界之間邊是一導(dǎo)較電低電而位度較梯的區(qū)陡域它推，動品樣的中肽多前移在分并離膠前積沿聚此處pH值較高，，利于甘氨有的酸子化離，所成的甘氨酸形離穿子堆過的集多并緊隨氯肽離之子后，分離沿泳動膠從。移界動面中解后脫S，D多S復(fù)合肽成物一電位pH和值勻的均區(qū)泳帶動過分離膠，并穿篩被分依而各的大小得到自離。按所需分離分蛋白的質(zhì)分子小選擇大適的丙合烯胺百分比濃度酰一般，，5地％的凝膠可于用6～020k0Da的SD變S蛋白質(zhì)性分子的分，離01％于用6170kD～a15％，用1于2～54Dk。 a（

一）材、料：1

30．%（WV/）car凝y貯存膠液丙

酰胺烯 9g，2亞甲雙丙烯胺酰 1g加ddH2O 溶 1至00lm,新華濾紙過濾，棕用色中瓶4保存，℃月后重新配制。數(shù)

2 1..5ol/m TLis-rHl pC 8H.8

risT abe s1.851 g

加dd2O 5H0lm,加濃酸鹽pH 至.8(84約ml,讓溶液)卻至室溫冷再用d，Hd2定O容至100ml.

.3 1.0ml/o TLrsi-Cl pHH6 8.

Tris abse 2.11 g加

ddH2O 05lm,加濃鹽酸p至H6. 8約8ml),讓溶(液冷至室卻，溫用再dH2Od容定10至0lm .

4．.05mo/L lrTs-HCil ,Hp6.8

Tris b sa e.60g

加 6ml dd02OH加,鹽濃酸p至 6H.,定容至801ml 05.

1%0 DSS:S SD01克，溶于dd2OH 001lm

6.1.% 0硫酸銨過APS（）：過硫酸提銨驅(qū)供丙烯酰動和亞胺丙烯甲胺酰合聚必所的需由自基過硫。酸100m銨g溶于d，H2dO 1ml .溶后解裝，-2分0度保。存

7TEMED .（四甲基乙胺二T）MEE通過催化過D硫酸銨成自形由基而加速烯丙酰胺N和N’-,亞丙甲烯酰的胺聚合

.8 Tis-甘氨酸電r泳沖緩,液 p H.3 （ 5 8

×貯液）存：rTi sabs e5.11g 甘

氨 7酸g2

10%SD 5S0ml 或S（SD 50.g

）加dH2O至d010ml0

.96×樣品沖液緩10ml0 0

5.mo/l Tris-HCL(lHp68) 7.ml06(m0olmL)/

甘油 03l(m2%)

S5SD 1g

0DT T.93g 溴

酚 1藍2mg

ddH O 2100

至4�！鏀�(shù)周，或存-20保℃數(shù)月存DTT或（B者ME用前加在）

入()二操、方作：

1．將玻法板洗干璃，固凈于電泳槽定；

上2．實按要驗求制配不同度的濃離膠分，入T加MED后E迅速灌膠留，灌出注濃縮膠需所空間梳（子齒長再加1的cm），上用部或30水乙%醇封面或0（1%.DS(S丙烯酰濃度胺≤8)%異丁醇或丙（烯胺濃�！荻�01））% 。

．3制濃配膠縮：實驗要按配制不求濃同的度離膠分一次，使性塑料管中配用制適合積體濃度的與濃縮膠加，入ETME后應(yīng)D速快旋混合轉(zhuǎn)，速迅入濃縮膠。灌

．灌注4濃膠：待縮離分完膠全合后（約聚03mi）,傾n出蓋層液覆，dd用H2O滌洗膠凝頂數(shù)部次以，除未去合的丙聚酰烯胺，用再紙小條吸濾凈留的液體殘，配制好縮膠濃迅后速入灌，立并在即縮濃膠中液入插凈的干梳,子再入加縮濃溶膠，以充液滿梳子間的隙空梳子用用前水洗清干，凈用前用臨乙醇擦拭揮發(fā)，至），確干無氣保泡；待膠完全聚合凝后3（m0in,）心取出梳小子清洗加，槽，樣凝膠放將入泳電槽；將電泳內(nèi)緩液加入沖內(nèi)電脈外中槽使凝膠的上，端均能浸下泡在沖液中緩，除加排孔樣內(nèi)可的空能。泡

．樣5處品：理將白蛋樣品質(zhì)與×6SS樣品D理液處（25μl5+μl）在，一子個PE中混管合，01℃0加熱1min0，浴冷卻冰離，1心,加s；樣6

加．：用微量加樣樣器將白蛋樣質(zhì)品（體總在40積μ內(nèi)l，按測照蛋得的白，量算相對得加入體積數(shù)）加的樣品入的底孔部，隨料水平染高升升而高射注針頭器�？酌繕拥纳献畹按蟀祝�2量040~gμ為了避。邊免緣效應(yīng)，未加在孔中樣加等入量樣品緩沖液. 的須加體等積空的1×白DSS品緩沖樣液以防，相泳鄰道品的樣散擴。

7 ．泳電：電極插將與頭適當電極相連的電，應(yīng)流流陽極向；將壓電調(diào)至80V跑完，濃縮膠后，將電升壓高到100－201，V料的染前遷移沿至凝的膠部,底關(guān)閉源，電拔電掉極插頭從電，槽中泳出取膠玻凝板，小心移動兩玻璃璃間的隔板，將片插入兩塊其玻板的璃一角，輕撬開玻輕板璃凝膠，于其中的一貼塊上于，左邊一孔凝最下膠切去部一角以標凝膠的示向，方用印跡分析于則，不角。切

．8色染：考斯亮馬藍染色

考馬亮藍染斯：考液斯亮藍馬-R52 0.1 甲醇g 405lm dHdO24 0m5 冰醋酸 10lml 過濾0常溫保，存；

馬考斯亮藍脫液：色甲醇 45m l醋冰 1酸ml0d Hd2 O4m5

將l凝膠于染色液中置至少5倍（體積染的液浸泡凝膠，）于搖床平放上臺室溫染，4色時以小，上移凝膠并回收染液，出再

將凝膠浸于脫泡色液中仍，置搖于平床臺，上色4脫~8時小，間其換脫色3~液次4（脫色容器中一放小塊海以綿吸洗附脫來下的染料。）四

蛋白、從質(zhì)SDS聚烯丙酰凝胺轉(zhuǎn)移膠固至支相持

(體一)儀器電轉(zhuǎn)移裝、：置CN，PVFD膜W、hamatnMM濾３、搖床等紙

（）、二電移緩沖液：轉(zhuǎn)甘氨2酸9.gT rs 堿 5i.g SD8S .07g3甲醇200ml 加

ddH2O1至000m l

（三、）作操聚：（濕步：相同-轉(zhuǎn)7V，02，h4V1 ）

1．dHdO清2電洗極板吸水，揩干液滴；紙

2戴手．，切套6濾紙張1與張PVF膜，與D凝膠大小致一并，標；記

3 P．DFV膜先于泡10%甲0醇ddH，O漂洗2m５i,n浸入轉(zhuǎn)電移液中注，驅(qū)意濾膜除的氣泡；

上．在4淺托一中盤入加少量電轉(zhuǎn)移液，的把張３６M浸泡M其中；于 5．安裝

移轉(zhuǎn)裝置

a：平．放部底極電陽（），石墨極邊朝一；上

b．這一電在極放置３上張轉(zhuǎn)移用浸泡液的過３MM濾，疊放紙對齊，后用然玻移璃液作滾管，擠筒出濾紙間的'有氣所；泡

c．P DVF膜置放濾于上，精紙確對齊并排，氣泡；

出．從電d槽上撤出泳置放膠凝玻的，把凝璃膠轉(zhuǎn)移一盤去離子至水中為漂略洗，后然準確放平PV于D膜上F把凝前，左下角置的膜的于標記角上排，除氣；泡e

把后３．濾張紙置在放膠凝上方同樣，確保層各確對齊精不，氣泡。留

６．將靠上的電方極（陰）放極于層物上，平石一墨邊下朝，接連源，電據(jù)凝根面膠按0.積65A/mc2m接電通，流轉(zhuǎn)移１小電時左右；干轉(zhuǎn)半0.是3A0電(壓從4可伏到1上2伏右)

左７斷開電源，．拆除轉(zhuǎn)移置裝去除，層，把各膠轉(zhuǎn)移凝至至盛考有斯亮藍馬染的托液中盤行染色進，以檢查蛋質(zhì)轉(zhuǎn)白是移否全完，PV將F膜浸泡D于離子水中去驅(qū)除氣泡，然后，用春紅Ｓ麗進染行色

五。、固定于PVD對膜上的F白質(zhì)蛋進行色染

采用春紅麗染色Ｓ：麗春法S紅染色可法所有與疫免檢學方測兼法容，這是為因該料只染短暫顯色會而且在進行Wetsren印跡時可被洗。去因此麗，春紅染色S不影響隨并用后于測抗檢的原色反顯，應(yīng)些這顯色應(yīng)反由是偶已抗聯(lián)的堿性體酸酶或乳磷氧化物酶等過催化的然而，由。于其顯示紫的紅色容不易攝拍來，這下染色不種提供永久能性驗記實錄　１．10x麗春

Ｓ貯紅液存：春麗紅２Ｓ,g三　乙氯3酸g,0 磺水楊基30g酸加，水至001l

m�。玻ǎ悍�

a. 把濾放入膜有麗春紅Ｓ含使用的液盤中托色染510m~in,輕搖，

.b蛋帶出現(xiàn)后，白室溫用dd于2H漂O洗，間換期數(shù)次水；六

、閉封特異非性結(jié)位合點

將　放膜入可熱加接封的料袋塑，中據(jù)根膜面，以0積.1l/mm2c的加量入閉液（5封%脫奶粉脂0，.%1Ｔeen w20P于B或SBS），盡T可排除能氣泡，密，平放封搖于床平臺上，溫溫室１育２小～時

七、。

一抗

取出膜在PBST洗滌5中imnX3；將膜次入可加熱放接的塑封袋中料，加合入適度的濃抗一室，溫育溫小2時或3 C 71時小

、二八抗取

出膜在PBST洗滌15中mniX3次將膜放入可；熱封加接的料袋塑中加入合適濃度的二，，室溫抗溫1育時或小73 C 05.小時

，九E、CL光檢測