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植物組織蛋白質(zhì)提取方法
用200毫摩每升的tris-cl 和62.5毫摩每升的tris-cl,我們研究室一般用１００毫摩每升的tris-cl，pH 8.0 ．另外，最好加１５０毫摩每升的ＮaCl，用來(lái)分離以弱電荷結(jié)合到多糖上的蛋白。
2我提的蛋白難溶，請(qǐng)問(wèn)怎么解決？1、請(qǐng)問(wèn)這是為什么呢？怎么解決？2、溶解時(shí)是先在100℃沸水浴后在渦旋嗎？3、渦旋時(shí)產(chǎn)生大量泡沫，對(duì)蛋白有影響嗎？4、是在常溫溶解還是在4℃？或-20℃？5、一般溶解需要多長(zhǎng)時(shí)間？怎樣才算溶解充分了？
我也是做植物葉片的，建議你可以用TCA-丙酮沉淀，方法如下：1、在液氮中研磨葉片30min，加PVP，和石英砂2、加入樣品體積3倍的提取液(丙酮溶液1)在-20℃的條件下過(guò)夜，然后離心（4℃10000rpm以上1小時(shí)）棄上清。3. 每份加入9ml丙酮溶液II，搗碎沉淀，常溫振動(dòng)混勻，-20℃沉淀1h；10000rpm，4℃離心15min，棄上清.4. 每份加入9ml丙酮溶液II，常溫振動(dòng)混勻，-20℃沉淀1h；10000rpm，4℃離心15min，棄上清.5. 每份加入9ml 80%丙酮溶液III, 常溫振動(dòng)混勻，-20℃沉淀1h, 10000rpm，4℃離心15min，棄上清6．干燥成硬塊，磨成粉磨-20℃保存待用。
第二個(gè)問(wèn)題：37度水浴
第三個(gè)問(wèn)題：渦旋時(shí)產(chǎn)生大量泡沫，沒有影響第四個(gè)問(wèn)題：37度溶解
第五個(gè)問(wèn)題1個(gè)小時(shí)，中間混勻數(shù)次
出現(xiàn)這種情況是很正常的，要是全部都溶了倒是不太正常。用沉淀法濃縮蛋白都存在一個(gè)變性的問(wèn)題，在具體的操作過(guò)程中，有一部分蛋白變性了，所以會(huì)不溶解。操作的時(shí)候盡量保持低溫！溶解的時(shí)候可以在常溫下，蛋白變成粉末后，立即加1*SDS上樣緩沖液，用加樣器吹打，大約5分鐘就好，可以用來(lái)進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。也可以在4度溶解過(guò)夜。渦旋時(shí)產(chǎn)生大量泡沫，個(gè)人認(rèn)為影響不大一般溶解半個(gè)小時(shí)就很充分了，但仍會(huì)有很多不溶物！可以離心棄掉！ 丙酮沉淀之后要干燥，這個(gè)過(guò)程一定不要時(shí)間太長(zhǎng)，不然樣品干燥得過(guò)了，就很難溶了。即使你加上了硫脲，高濃度尿素也不行。我的經(jīng)驗(yàn)是只要半個(gè)小時(shí)左右就足夠了，表面上看上去比較干就可以了。
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