BAC-FISH技術(shù)在植物基因組研究中的應(yīng)用

時(shí)間：2022-02-26 19:09:05 好文我要投稿

　　論文導(dǎo)讀:：本文將主要討論BAC-FISH技術(shù)的原理。比較作圖研究。功能基因定位。

BAC-FISH技術(shù)在植物基因組研究中的應(yīng)用

　　關(guān)鍵詞：BAC-FISH，染色體核型分析，比較作圖，基因定位

　　原位雜交技術(shù)是一項(xiàng)利用標(biāo)記的DNA或者RNA探針直接在染色體、細(xì)胞或組織水平定位特定靶核酸序列的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。它的產(chǎn)生標(biāo)志著傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)向現(xiàn)代分子遺傳學(xué)技術(shù)的轉(zhuǎn)變。原位雜交技術(shù)自從產(chǎn)生以來，得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。從放射性標(biāo)記到熒光標(biāo)記；從單探針到多探針；染色體的制備也從傳統(tǒng)的中期染色體、粗線期染色體，再到DNA纖維，原位雜交技術(shù)在其檢測(cè)的精確度和靈敏度上得到了極大地提高。但是，由于受到信號(hào)檢測(cè)能力的限制，傳統(tǒng)原位雜交技術(shù)中運(yùn)用最多的還是5S和45S rDNA、端粒以及著絲粒等區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)序列，單拷貝或低拷貝小片段在原位雜交中很難檢測(cè)到。

　　細(xì)菌人工染色體熒光原位雜交(BAC-FISH) 是以細(xì)菌人工染色體(BAC) 克隆作為探針進(jìn)行的染色體原位雜交，由于克隆的外源片段一般為100 kb以上，其探針與靶DNA序列相遇的機(jī)會(huì)大，雜交信號(hào)檢出率大大提高。因此，它較單拷貝或低拷貝小片段DNA序列雜交更為容易，而且準(zhǔn)確可靠，從根本上克服了過去單拷貝DNA雜交的困難，大大促進(jìn)植物尤其是二倍體物種基因組的研究，現(xiàn)已成為植物核型分析、基因定位及物理圖譜構(gòu)建等分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的有力工具。本文將主要討論BAC-FISH技術(shù)的原理，在植物基因研究中取得的重要成果以及新的發(fā)展方向。

　　1 BAC-FISH技術(shù)的原理和優(yōu)勢(shì)

　　BAC-FISH中應(yīng)用的BAC探針主要有兩種。第一種是含有染色體特異的散布式重復(fù)序列的BAC片段。以一個(gè)或多個(gè)這樣的BAC片段作為探針，其信號(hào)能夠覆蓋整條染色體，所以該方法又稱之為染色體涂染（chromosome painting）[1]。染色體涂染技術(shù)最早來自于哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳學(xué)研究，由Pinkel 等人建立，并用于檢測(cè)人類21號(hào)染色體的三體細(xì)胞[2]。目前在哺乳動(dòng)物、鳥類及爬行動(dòng)物染色體的研究中應(yīng)用十分廣泛。染色體特異的散布式重復(fù)序列是哺乳動(dòng)物基因組的一大特點(diǎn)，通過流式細(xì)胞儀或顯微切割技術(shù)獲得含有染色體專一性重復(fù)序列的BAC片段，以這些BAC作為探針能夠在細(xì)胞核中鑒定出不同的染色體。探針中含有的少量共有序列，可以在雜交前或雜交時(shí)通過加入過量的基因組DNA封阻掉。與動(dòng)物基因組不同，植物中的散布式重復(fù)序列往往分布于整個(gè)基因組的不同染色體上[3, 4]。這些序列在雜交過程中很難被封阻，從而使得染色體涂色染技術(shù)在植物中很難實(shí)現(xiàn)[5, 6]，目前僅在擬南芥及其近緣源物種中得到成功應(yīng)用[7, 8]。

　　BAC-FISH中使用的另一種探針是，含有單拷貝序列的染色體特異性BAC。利用分布于同一染色體上的一個(gè)或者多個(gè)含有單拷貝序列的BAC片段對(duì)染色體進(jìn)行雜交。通過雜交信號(hào)在染色體上的分布進(jìn)行染色體識(shí)別，以及結(jié)構(gòu)和變異的研究[9]。盡管這些探針的信號(hào)不能覆蓋整條染色體，但是包含其中任何一個(gè)探針的染色體重組都是能夠被檢測(cè)到的，片段丟失和重復(fù)也能夠通過信號(hào)數(shù)量的變化檢測(cè)到。這種染色體特異的單拷貝BAC片段是BAC-FISH技術(shù)在植物中使用的主要探針類型。利用該技術(shù)，已經(jīng)在植物中揭示了許多重要的染色體進(jìn)化事件，包括首次在植物中檢測(cè)到的著絲粒重排事件[10]。在使用BAC制備探針的過程中，含有著絲粒等染色體共有重復(fù)序列區(qū)域的BAC必須去除掉，因?yàn)樗鼈儠?huì)在多個(gè)不同的染色體上產(chǎn)生雜交信號(hào)。此外，在雜交過程中，該基因組的Cot-1 DNA也往往被用作封阻對(duì)基因組DNA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性雜交。Cot-1 DNA僅僅含有高度和中度重復(fù)序列，在雜交過程中可以有效封阻掉探針中的重復(fù)序列，從而避免探針中重復(fù)序列與染色體產(chǎn)生非特異性雜交。

　　與其它的原位雜交探針相比，染色體專一性BAC探針具有以下優(yōu)勢(shì)。首先，針對(duì)每一條染色體的探針都是特異的，這樣就極大地提高了鑒定的準(zhǔn)確性。其次，該技術(shù)對(duì)染色體制備的要求不高，可以檢測(cè)幾乎所有分裂周期中的染色體，甚至染色體片段[9]。在染色體較小的情況下，多個(gè)雜交信號(hào)往往會(huì)互相干擾甚至重疊，而BAC-FISH技術(shù)對(duì)每一條染色體的探針都是專一性的，不依賴與雜交信號(hào)在染色體上的分布模式，所以該技術(shù)尤其適合用于小染色體植物[9, 11-17]。

　　2 BAC-FISH在植物染色體研究中的應(yīng)用

　　2.1染色體識(shí)別及核型研究

　　染色體的正確識(shí)別是進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)�；贔ISH的染色體識(shí)別技術(shù)，不依賴于染色體的凝縮程度或者臂比的測(cè)量，可以在細(xì)胞分裂的所有時(shí)期將染色體鑒定出來，從而可以研究整個(gè)細(xì)胞周期中，染色體的行為以及在細(xì)胞核中的空間分布[18, 19]。核型研究中運(yùn)用最多的是5S和45S rDNA、端粒以及著絲粒等區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)序列[9, 20-23]。這些重復(fù)序列在基因組內(nèi)往往會(huì)有多個(gè)雜交位點(diǎn)，根據(jù)這些信號(hào)位點(diǎn)在不同染色體上的分布模式，我們可以區(qū)分開同一細(xì)胞核中不同的染色體[24, 25, 26]。利用重復(fù)序列探針鑒定染色體存在的一個(gè)問題是，雜交信號(hào)在同一個(gè)物種的不同個(gè)體間會(huì)存在差異，從而會(huì)影響我們從不同個(gè)體中識(shí)別出相同的染色體。此外，局限于雜交位點(diǎn)以及探針種類的限制，特別是當(dāng)不同的染色體表現(xiàn)出相近的雜交模式時(shí)，這種方法就難以對(duì)非同源染色體進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分[9]。

　　BAC-FISH技術(shù)利用染色體專一性BAC片段作為探針，探針信號(hào)在染色體上的分布是唯一的，從而可以避免傳統(tǒng)原位雜交技術(shù)在染色體識(shí)別上的困難。BAC-FISH技術(shù)首先在水稻、擬南芥等模式植物中取得了成功，目前已經(jīng)成功地應(yīng)用到了許多植物染色體鑒定與核型分析的研究中。在水稻中，單個(gè)的BAC序列早在1995年就被成功定位到了相應(yīng)的染色體上[27]。隨后，Cheng等人利用24個(gè)染色體臂專一性的BAC克隆，成功地區(qū)分出了水稻的12對(duì)染色體上，并結(jié)合已有的著絲粒探針，建立起了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的水稻染色體核型[28]。這些探針還被成功應(yīng)用到了同屬的其它野生稻物種中，說明染色體專一性BAC片段在近緣物種中具有較強(qiáng)的通用性[17]。除此之外，BAC-FISH技術(shù)也被成功地用于其它玉米、高粱、小麥等禾本科植物的染色體的鑒定與核型研究中[15, 29-31] [4, 32]。

　　擬南芥基因組較小，含有的散布式重復(fù)序列相對(duì)較少，因此它是目前唯一一種成功應(yīng)用染色體涂染技術(shù)的植物。Lysak等人將139個(gè)BAC序列混合作為探針，成功地標(biāo)記出了4號(hào)染色體的全部區(qū)域。這些探針在能在減數(shù)分裂的所有時(shí)期識(shí)別出4號(hào)染色體或者其分布區(qū)域[7]。利用多色熒光原位雜交技術(shù)，他們進(jìn)一步鑒定出了擬南芥的所有5對(duì)染色體[8, 33]。

　　隨著越來越多的植物BAC序列文庫(kù)的構(gòu)建，大量的BAC片段被定位到同一條染色體上，從而構(gòu)建出越來越詳細(xì)的染色體核型[34-36]。減數(shù)分裂粗線期染色體通常是有絲分裂中期染色體的10-20倍，適用于高分辨率的BAC-FISH作圖，能夠清晰地顯示染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及探針的位置[37, 38]。Iovene等人將30個(gè)在遺傳圖譜上定位的BAC片段成功雜交到了馬鈴薯粗線期的6號(hào)染色體[35]。FISH的結(jié)果清晰地顯示了著絲粒及近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)的位置。最近，Tang等人通過多色熒光原位雜交技術(shù)，將60個(gè)在RFLP遺傳圖譜上定位的BAC片段作為探針，成功地在粗線期鑒定出了馬鈴薯的全部12對(duì)染色體[39]。平均每條染色體分布有5個(gè)BAC片段，這些探針主要分布于染色體的常染色質(zhì)區(qū)，與它們?cè)谶z傳圖譜上相對(duì)應(yīng)的位置。通過建立這樣一個(gè)基因組范圍的細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜，得到了一個(gè)詳細(xì)可靠的馬鈴薯粗線期染色體核型，并將遺傳圖譜和物理圖譜信息結(jié)合到了一起。

　　棉屬多倍體植物，由于大量重復(fù)序列的存在使得篩選到合適的BAC片度較為困難。此外，棉花染色體較小而多，細(xì)胞質(zhì)濃厚且容易覆蓋在染色體上，因而難以獲得易于進(jìn)行原位雜交的染色體制片。研究人員通過選擇棉花分子遺傳圖譜中高重組區(qū)的微衛(wèi)星位點(diǎn)(simple sequence repeats，SSR) 標(biāo)記的策略，篩選到不含或含有少量重復(fù)序列的細(xì)菌人工染色體(BAC) 克��；同時(shí)，在通用FISH 技術(shù)程序基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)發(fā)生根、變性、洗脫條件等步驟, 構(gòu)建出適合于棉花的BAC-FISH 技術(shù)，簡(jiǎn)化了操作流程的同時(shí)，獲得穩(wěn)定的雜交結(jié)果及較高的檢出率；并通過將一隨機(jī)獲得的BAC 進(jìn)行染色體的物理定位，進(jìn)一步引入雙探針、雙色及重復(fù)雜交技術(shù)，成功地將BAC-FISH技術(shù)引入到棉屬植物染色體研究中[40]。通過該技術(shù)他們首先篩選到7個(gè)可以用于BAC-FISH的探針，并成功地鑒定出了多倍體中相應(yīng)的染色體[41]。通過進(jìn)一步篩選，成功地鑒定出了四倍體棉花全部的26對(duì)染色體[42]。這些BAC探針可以準(zhǔn)確地將每條染色體對(duì)應(yīng)到相應(yīng)的連鎖群。比較這26個(gè)BAC片段在染上的位置，發(fā)現(xiàn)他們都位于染色體的末端或近末端。由于這些BAC片段與遺傳連鎖圖譜上的標(biāo)記相對(duì)應(yīng)，所以說明棉屬植物的染色體交換主要發(fā)生在染色體末端區(qū)域。通過將于遺傳圖譜相對(duì)應(yīng)的BAC片段在染色體上的定位，將有助于我們?cè)u(píng)估遺傳圖譜標(biāo)記對(duì)染色體的覆蓋程度，從而推動(dòng)棉屬植物的基因組研究。

　　2.2比較作圖研究

　　在水稻和玉米中的研究發(fā)現(xiàn)，基因序列以及排列順序在近源物種中是相對(duì)保守的，所以富含基因區(qū)的BAC探針在近源緣物種中具有較好的通用性[17, 43]。將這些BAC片段在近緣物種中進(jìn)行雜交，比較雜交信號(hào)的分布，即比較作圖技術(shù)，可以廣泛應(yīng)用于近緣物種染色體的共線性分析，以及結(jié)構(gòu)變異，從而為研究染色體的進(jìn)化提供了便利[1]。Lysak等人利用擬南芥染色體專一性探針，對(duì)近緣的多個(gè)蕓薹屬物種染色體進(jìn)行雜交，通過比較這些探針在不同物種染色體上的分布，揭示了在這些物種進(jìn)化歷史上發(fā)生的一系列基因組加倍和染色體結(jié)構(gòu)變異事件[8, 44]。

　　在茄屬植物中，BAC-FISH首先被應(yīng)用到了馬鈴薯6號(hào)染色體與其它茄屬植物染色體的比較中[35, 45]。通過比較30個(gè)來自于馬鈴薯6號(hào)染色體的BAC雜交信號(hào)在西紅柿6號(hào)染色體上的分布, 發(fā)現(xiàn)這些BAC片段在兩個(gè)物種的6號(hào)染色體上是完全共線性分布的,但是異染色質(zhì)的分布模式有很大的不同。同時(shí)通過比較雜交信號(hào)的排列順序，還發(fā)現(xiàn)在6號(hào)染色體短臂的常染色質(zhì)區(qū)存在一個(gè)倒位片段。該倒位片段是以前基于遺傳圖譜比較所沒有發(fā)現(xiàn)的，這說明相對(duì)于傳統(tǒng)的遺傳學(xué)圖譜，高密度的細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜具有極強(qiáng)的檢測(cè)染色體變異的能力。同樣，利用BAC-FISH技術(shù)，通過比較比較馬鈴薯和西紅柿的5號(hào)，也發(fā)現(xiàn)了同臂內(nèi)的倒位[46]。Lou等人進(jìn)一步將其中的13個(gè)BAC片段雜交到了茄屬的其他物種中[47]。利用這些標(biāo)記，他們對(duì)包括馬鈴薯、西紅柿、茄子等在內(nèi)的7個(gè)茄屬物種的6號(hào)染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，研究了6號(hào)染色體在茄屬植物中的進(jìn)化。結(jié)果顯示，6號(hào)染色體在這些植物間具有相似的形態(tài)，近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)在所有物種中都有發(fā)現(xiàn)。這13個(gè)克隆在Solanum caripense， S. melongea，馬鈴薯，以及另外兩個(gè)野生馬鈴薯物種中是完全共線性分布的，并且定位在了非常相似的位置。但是在S. etuberosum 中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)包含整個(gè)近著絲粒異染色質(zhì)區(qū)在內(nèi)的巨大倒位片段，分布于該區(qū)域的4個(gè)BAC片段的排列順序與其余6個(gè)物種是完全顛倒的。通過臨近區(qū)域其它幾個(gè)BAC的位置，確定了導(dǎo)致該倒位的斷裂點(diǎn)，位于兩個(gè)BAC片段之間，該長(zhǎng)度大約為6號(hào)染色體的1%。這是首次在茄屬植物中發(fā)現(xiàn)染色體臂間倒位事件。該研究通過在不同物種中比較BAC-FISH作圖的結(jié)果，還首次建立了一個(gè)茄屬植物6號(hào)染色體的祖先核型。

　　由于棉花減數(shù)分裂粗線期染色體較難獲得，并且大量的染色體進(jìn)一步增加了高質(zhì)量粗線期染色體制片的難度[48]。所以以前對(duì)棉屬植物染色體的研究主要集中在有絲分裂或減數(shù)分裂的中期染色體上[41, 42, 49-52]。通過進(jìn)一步改進(jìn)染色體制備技術(shù)，利用高濃度長(zhǎng)時(shí)間的果膠酶和熱處理來分散細(xì)胞，Wang等人在棉花中制備出高質(zhì)量的粗線期染色體制片，并成功應(yīng)用到了棉花BAC-FISH的研究中，進(jìn)一步提高了BAC-FISH在棉屬植物染色體研究中的分辨率和靈敏度[53]。利用該技術(shù)，它們對(duì)棉屬多倍體A和D基因組的12號(hào)染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[54]。32個(gè)被SSR標(biāo)記定位到遺傳圖譜上BAC片段，通過原位雜交的方法成功定位到了12號(hào)染色體上。綜合分析這些BAC片段的遺傳距離和物理距離發(fā)現(xiàn)，大部分標(biāo)記在A和D基因組的12號(hào)染色體上是共線性分布的，但是這兩對(duì)染色體在基因組組成、結(jié)構(gòu)和大小上有著明顯的差別。這種差異在染色體上是不均勻分布的，在末端區(qū)域差異較小，差異最大的區(qū)域存在于長(zhǎng)臂近著絲粒的區(qū)域。這種基因組的差異主要源于染色體在不同區(qū)域不均衡的擴(kuò)張和收縮。這些結(jié)果對(duì)研究棉屬多倍體基因組進(jìn)化起了很好的指導(dǎo)作用，并為以后的全基因組測(cè)序奠定了基礎(chǔ)。

　　BAC-FISH在其他植物比較作圖中的研究包括，利用來自高粱9號(hào)染色體的32個(gè)BAC片段分別對(duì)高粱和玉米染色體進(jìn)行雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的標(biāo)記在兩個(gè)物種的基因組中都是共線性分布的，但是信號(hào)之間的相對(duì)位置有些差異，這說明玉米9號(hào)染色體的一些區(qū)域發(fā)生了不均等的擴(kuò)張[55]。在葫蘆科植物染色體比較作圖中的研究，首次發(fā)現(xiàn)了植物中的著絲粒重排現(xiàn)象[10]。該研究結(jié)果顯示，葫蘆科植物著絲粒的活性與其近著絲粒區(qū)域的異染色質(zhì)緊密相關(guān)，著絲粒的激活與休眠都伴隨著其附近區(qū)域異染色質(zhì)的大量獲得和丟失。比較染色體作圖為我們提供了一條研究相關(guān)物種中染色體共線性、重排的新方法，該方法不依賴于作圖群體，并且能揭示出染色體重排事件的物理特征，如異位、倒位等[35,44-45]。隨著越來越多的.BAC文庫(kù)的建立，基于BAC-FISH的比較染色體作圖研究將越來越廣泛。

　　2.3功能基因定位

　　原位雜交技術(shù)對(duì)探針的長(zhǎng)度具有一定的要求。雖然有報(bào)道成功檢測(cè)到1-3kb的單拷貝片段，但是其結(jié)果往往很不穩(wěn)定，甚至難以重復(fù)[9, 56-60]。用傳統(tǒng)的原位雜交方法，單拷貝的基因片段很難觀察到雜交信號(hào)。BAC中的插入片段較長(zhǎng)，很容易與靶DNA結(jié)合，因此可以利用目的基因所在BAC片段，方便地將其定位到染色體上。從1995年，Jiang等人[27]運(yùn)用BAC-FISH技術(shù)首次將Xa-21定位到染色體上以來，一系列的功能基因被成功地定位到了染色體上[42, 46, 61-68]。

　　在一些沒有全基因組序列的物種中，利用BAC-FISH技術(shù)定位基因顯得尤為重要。例如馬鈴薯的5號(hào)染色體上存在一個(gè)遺傳上的熱點(diǎn)地區(qū)，該區(qū)域存在一系列對(duì)不同病原體具有抗性的基因，通過遺傳作圖發(fā)現(xiàn)這些基因位于兩個(gè)遺傳作圖標(biāo)記間3 cM大小的區(qū)域，但是該區(qū)域在染色體上的位置及長(zhǎng)度始終不清楚。為了精確定位該區(qū)域在染色體上的位置，研究人員從馬鈴薯的BAC庫(kù)中，選擇與該區(qū)域相關(guān)的5個(gè)BAC片段作為探針，對(duì)馬鈴薯和西紅柿的5號(hào)染色體進(jìn)行原位雜交。將該區(qū)域定位到了5號(hào)染色體長(zhǎng)臂的中間區(qū)域，在兩個(gè)物種中。同過測(cè)量信號(hào)間的距離，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的長(zhǎng)度在馬鈴薯和茄子中分別為0.85和1.2 Mb[46]。利用BAC-FISH的方法，研究人員還將棉花的乙烯反應(yīng)原件結(jié)合因子（ethyleneresponsive element-binding factor）定位到了A基因組的7號(hào)染色體上[42]。

　　將BAC-FISH與其他的細(xì)胞遺傳學(xué)材料結(jié)合，例如DNA纖維[56]，機(jī)械伸展的染色體[9]，能精確定位相鄰的BAC片段在染色體上的排列順序，從而進(jìn)一步提高基因定位的精確度[66, 67, 69-74]。例如，Tomita等人利用5個(gè)BAC片段作為探針，結(jié)合Fiber-FISH技術(shù)，將抗煙草花葉病毒基因（tobamovirus resistance gene L3）定位到辣椒的11號(hào)染色體大約400kb的區(qū)域，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些BAC間的空白區(qū)域大約為30Kb[67]。

　　3 BAC-FISH技術(shù)的發(fā)展及展望

　　DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，使得植物全基因組測(cè)序成為可能。但是幾乎所有現(xiàn)行的基因組測(cè)序技術(shù)都會(huì)留下一些未能測(cè)通的空白區(qū)域，BAC-FISH技術(shù)能對(duì)這些空白區(qū)域的大小及在染色體上的位置準(zhǔn)確判斷，從而為制定相應(yīng)的補(bǔ)全策略提供指導(dǎo)[75, 76]。此外，對(duì)于一些特殊的基因組區(qū)域，F(xiàn)ISH技術(shù)仍然是確定其序列，并在染色體上精確定位的唯一方法。例如，含有高度重復(fù)序列的著絲粒、端粒等區(qū)域，這些區(qū)域含有大量串聯(lián)重復(fù)序列，很難被測(cè)通。以這些含有這些重復(fù)序列的BAC片段為探針，結(jié)合Fiber-FISH等技術(shù)能夠幫助我們確定這些重復(fù)序列的拷貝和相對(duì)位置[9]。

　　傳統(tǒng)的FISH技術(shù)只是把DNA序列定位到染色體上，但是許多生物學(xué)問題不能由這樣的簡(jiǎn)單的定位信息來解釋。將FISH技術(shù)與蛋白質(zhì)免疫雜交相結(jié)合所產(chǎn)生的免疫-原位雜交技術(shù)，可以將特定的DNA段與其相互作用的蛋白同時(shí)定位到染色體上，為我們提供更多的生物學(xué)信息[77-82]。這種技術(shù)已經(jīng)被成功用與研究組蛋白修飾與特定的基因組區(qū)域的關(guān)系[77-79, 81]，以及著絲粒特異性蛋白與特定重復(fù)序列間的關(guān)系[80, 82, 83]。將免疫-原位雜交技術(shù)與染色體伸展技術(shù)相結(jié)合，還可以進(jìn)一`步提高了DNA與蛋白相互作用研究的準(zhǔn)確度以及精確性[71, 72, 84]。利用該技術(shù)，研究人員將小麥和擬南芥的染色體同時(shí)標(biāo)記上組蛋白CENH3的抗體和著絲粒重復(fù)序列探針，從而揭示了著絲粒單元的排列順序，以及它們與相關(guān)蛋白的相互關(guān)系[72, 84]。

　　由于原位雜交中信號(hào)的強(qiáng)弱與染色體的狀態(tài)緊密相關(guān)，結(jié)構(gòu)松散的染色體區(qū)域能夠更好地與探針結(jié)合，從而產(chǎn)生強(qiáng)的信號(hào)；反之，染色體凝縮的區(qū)域與探針很難結(jié)合，產(chǎn)生的信號(hào)就很弱。因此，雜交信號(hào)的強(qiáng)弱可以成為判斷染色體狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。這在研究染色體結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)、調(diào)控的關(guān)系中特別重要[85, 86]。最近，研究人員將BAC-FISH與三維空間的原位雜交技術(shù)相結(jié)合，研究了根表皮發(fā)育過程中，染色體結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)以及細(xì)胞分化的關(guān)系，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄因子GL2附近區(qū)域染色體的狀態(tài)與細(xì)胞的分化緊密相關(guān)[87]。

　　利用BAC-FISH技術(shù)，以特定染色體專一性的BAC片段為探針，還可以研究染色體的行為。研究人員對(duì)玉米B染色體在花粉有絲分裂中的行為進(jìn)行了研究。利用B染色體專一性探針，對(duì)B染色體在不同細(xì)胞周期中位置和狀態(tài)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示在花粉細(xì)胞第一次有絲分裂時(shí)，B染色體的大多數(shù)能正常分離，但是在第二次有絲分裂時(shí)，大多數(shù)不能正常分離[88-91]。BAC-FISH技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展為我們了解染色體的細(xì)微機(jī)構(gòu)，以及染色體行為提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段。隨著越來越多的基因組被測(cè)序，對(duì)于染色體結(jié)構(gòu)和行為的研究將有助于我們更好地了解這些植物基因組的功能。

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