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采用GatewayTM技術構建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因重組腺病毒載體
目的:采用基于attLXattR的λ噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)的GatewayTM技術構建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因重組腺病毒栽體(Ad-hBMP-2).方法:從pcDNA3.1質(zhì)粒中獲取目的基因hBMP-2片段,連入帶attL1、attL2位點的入門載體pENTRTM11中.形成入門克隆,將入門克隆與帶attR1、attR2位點的目的載體Ad/CMV/V5-DEST在高效重組酶作用下發(fā)生體外重組形成表達克隆ad-BMP-2,經(jīng)鑒定將ad-BMP-2線性化后轉(zhuǎn)入293A細胞包裝,通過細胞裂解法獲得人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的基因重組腺病毒珠Ad-hBMP-2,將其擴增,采用western blotting技術分析目的蛋白表達.結果:經(jīng)酶切及測序證實目的基因BMP-2片段按正確方向重組入目的載體中,帶BMP-2的目的栽體在293A細胞中包裝成功,獲得成熟的病毒顆粒,測得病毒滴度為2.5×109pfu/ml.western blotting結果證實Ad-hBMP-2在293A細胞中高效表達hBMP-2蛋白.結論:本實驗首次利用基于λ噬菌體的住點特異性重組系統(tǒng)的GatewayTM技術成功構建了Ad-hBMP-2,該技術與傳統(tǒng)構建方法比較具有高效性和靈活性,為進一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2進行骨基因治療奠定了實驗基礎.
作 者： 蔣紅梅 龍潔 湯煒 田衛(wèi)東 劉磊 林云鋒 王杭 李鵬 JIANG Hong-mei LONG Jie TANG Wei TIAN Wei-dong LIU lei LIN Yun-feng WANG Hang LI Peng 作者單位： 四川大學華西口腔醫(yī)學院,成都,610041 刊 名： 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展 ISTIC 英文刊名： PROGRESS IN MODERN BIOMEDICINE 年，卷(期)： 2008 8(2) 分類號： Q78 關鍵詞： 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 GatewayTM技術 重組腺病毒【采用GatewayTM技術構建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因重組腺病毒載體】相關文章：
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